SVIBOR - Projekt broj: 1-08-058

MINISTARSTVO ZNANOSTI I TEHNOLOGIJE

Strossmayerov trg 4, HR - 10000 ZAGREB
tel.: (01) 459 44 44, faks: (01) 459 44 69
E-mail: ured@znanost.hr

SVIBOR

SVIBOR - Prikupljanje podataka o projektima u RH

Šifra projekta: 1-08-058


EKSPRESIJA GENA U MICELIJSKIM MIKROORGANIZMIMA


Glavni istraživač: PIGAC, JASENKA (37185)


Suradnici
Tip istraživanja: temeljno
Trajanje od: 01.01.91. do 31.12.95.
Ukupno radova na projektu: 23
Radovi na projektu citirani u Current Contents: 6
Naziv ustanove: Pliva - Istraživački institut, Zagreb (60)
Odjel/Zavod: Biosinteza i biotehnologija
Adresa: Prilaz baruna Filipovića 89
Grad: 10000 - Zagreb, Hrvatska
Komunikacija
Telefon: 385 (0)1 18-15-87
teleFaks: 385 (0)1 57-47-19
Sažetak: U istraživanjima na ovom projektu koristili smo se spoznajama i rezultatima dugogodišnjih proučavanja streptomiceta i aspergila u našim laboratorijima, kao i najnovijim dostignućima metodologija i tehnika za proučavanje ekspresije gena u ovim mikroorganizmima. Tehnika obilježavanja i hibridizacije DNA molekula omogućila je karakterizaciju sedam ranije izoliranih mutanata soja Streptomyces rimosus R6 blokiranih u biosinteznom putu oksitetraciklina (OTC) sa sondama različitih gena iz biosinteznog puta OTC-a. Po prvi puta je opisana i uvedena brza i pouzdana metoda za transformaciju streptomiceta elektroporacijom, što je omogućilo uvođenje različitih vektora kao i ugrađivanje i ekspresiju VHb-gena (hemoglobin gen iz bakterije Vitreoscilla) u kromosom soja S. rimosus R6. U toku je završetak konstrukcije soja S. rimosus R6 kojem će nedostajati dva okvira čitanja iz gena za poliketid sintazu (PKS). Transformacijom ovog soja bifunkcionalnim plazmidom koji sadrži aktinorodin-PKS gene, očekuje se biosinteza nove poliketidne molekule. Iz proizvodnog soja plijesni Aspergillus niger izoliran je i kloniran gen za glukoamilazu, kojim su transformirani različiti sojevi plijesni A. niger. Dobiveni transformanti analizirani su obzirom na proizvodnju glukoamilaze ovisno o broju kopija glukoamilaznog gena po genomu. Sintetiziran je i gen za humani proinzulin pomoću preklapajućih oligonukleotida u kombinaciji s PCR, i kloniran u dva tipa ekspresijskih vektora za plijesni. Ekspresija inzulinskog gena u različitim transformantima praćena je radioimunološkim određivanjem inzulinske aktivnosti.

Ključne riječi: Streptomyces rimosus, Aspergillus niger, ekspresija gena, homologni i heterologni produkti, oksitetraciklin,poliketidni antibiotici,glukoamilaza, humani inzulin

Ciljevi istraživanja: Streptomiceti i aspergili su micelijski mikroorganizmi slični po dobro izraženoj diferencijaciji, izlučivanju metabolita u podlogu, tvorbi heterokariona itd., a u biotehnologiji su poznati kao proizvođači antibiotika, odnosno enzima. Cilj projekta je ispitati način ekspresije gena za jedan primarni (glukoamilaza) i jedan sekundarni metabolit (poliketidni antibiotik, oksitetraciklin - OTC) u micelijskim mikroorganizmima. Potpuno sekvencirani slijed OTC-biosinteznih gena, raspolaganje raličitim vektorima (autonomni i integrativni streptomicetni, te bifunkcionalni) za sojeve S. rimosus R6 i 4018-Glasgow, otvara velike mogućnosti za uvođenje i ekspresiju homolognih i heterolognih gena u ove važne mikroorganizme. Ispitat će se na molekularnoj razini prisustvo, delecija ili preraspodjela skupine OTC-biosinteznih gena u ranije opisanih R6 mutanata blokiranih u biosintezi OTC-a, jer bi mogli poslužiti kao prikladni recipijenti za homologne/heterologne gene. Optimirat će se i primijeniti učinkovita metoda transformacije sojeva R6 i 4018-Glasgow, bez posredstva protoplasta. Pokušat će se ekspresijom bar jednog heterolognog gena povećati prinos OTC-a. Usmjerenom mutagenezom PKS-gena soja R6, te konstrukcijom različitih plazmida, omogućit će se konstrukcija sojeva i vektora prikladnih za biosintezu novih poliketidnih molekula. Cilj su ovih istraživanja nova saznanja o regulaciji i ekspresiji gena za glukoamilazu, o utjecaju broja kopija gena na ekspresiju glukoamilaze, te potencijalni sojevi za proizvodnju homolognih i heterolognih proteina. Za istraživanja ekspresije glukoamilaze u plijesni A. niger bit će odabrani različiti ko/transformanti, koji će biti analizirani s obzirom na ekspresiju glukoamilaze u odnosu na broj kopija glukoamilaznog gena po genomu. Kombinacijom kemijske i biokemijske metode sintetizirat će se gen za humani proinzulin, koji će biti pod kontrolom regulatornih slijedova glukoamilaznog gena. U gen za humani proinzulin uvest će se određene modifikacije radi izučavanja mogućeg pozitivnog utjecaja na ekspresiju i sekreciju humanog inzulina. Istraživanja vezana uz ovaj projekt važna su za razvoj nove biotehnologije kako u PLIVI tako i u Hrvatskoj. Nova biotehnologija trebala bi postati uskoro, prema predviđanjima mnogih autora, dominantna svjetska tehnologija.

SURADNJA - PROJEKTI


  1. Naziv projekta: 1-08-021 Struktura složenost i stabilnost genoma streptomiceta
    Naziv ustanove: Prehrambeno-biotehnološki fakultet
    Grad: 10000 - Zagreb, Hrvatska

  2. Naziv projekta: ALIS LINK No.007 Molecular genetics of oxytetracycline biosynthesis from Streptomyces rimosus R6, the oxytetracycline producer
    Naziv ustanove: University of Glasgow
    Grad: 441 - Glasgow, UK

SURADNJA - USTANOVE


  1. Naziv ustanove: Prehrambeno-biotehnološki fakultet
    Tip ustanove: Gospodarstvena/Proizvodna
    Grad: 10000 - Zagreb, Hrvatska

  2. Naziv ustanove: University of Glasgow
    Tip ustanove: Gospodarstvena/Proizvodna
    Grad: 441 - Glasgow, UK
Ostali podaci o projektu.
MZT Engleski jezik SVIBOR Abecedni popis Složeno po šifri projekta Složeno po ustanovi projekta Pretraga Pomoć
Ministarstvo znanosti
i tehnologije		 Engleski
jezik		 Svibor
početna stranica		 Abecedni
popis		 Složeno po
šifri projekta		 Složeno po
ustanovi projekta		 Pretraživanje Pomoć
Datum zadnje promjene: 11.10.95
Informacije: svibor@znanost.hr